1) Definizione del paziente e della storia
sesso:*femminile*
Anno di nascita : 1976
peso: 76kg
Anamnesi patologica prossima
1998: madre di 63 anni operata di melanoma linfocitario di II grado
2000: morte della madre, la paziente entra in cura da psicologo per depressione e ansia
2001: la paziente esce dalla cura, aumento di peso a 83kg, si consiglia di equilibrare la dieta con diminuzione di carboidrati e assunzione di magnesio, zinco e vitamine del gruppo B
2002: la paziente entra in cura psichiatrica per esaurimento nervoso, con assunzione di farmaci a base di benzodiazepine
2004 - melanoma a diffusione superficiale con aspetti polipoidi della regione addominale
Presenta modesto infiltrato linfocitario e rivela staging oncologico negativo
Anamnesi patologica remota
2011
Luglio
RM mammaria: formazione cistica del diametro di circa 40mm, circondata da multiple formazioni nodulari a margini netti.
si effettua agoscopia che rivela una neoplasia maligna scarsamente differenziata
Viene programmato un trattamento chirurgico di mastectomia e linfectomia ascellare
Settembre
Intervento di mastectomia radicale sx e linfectomia ascellare sx: l'esame istologico rivela una neoformazione plurilobulata di colorito nerastro , con estese aree emorragiche delle dimensioni di 7cm, sede di metastasi da melanoma pleomorfo in parte epitelioidi ed in parte cellule fusate.
Vengono evidenziate metastasi in 5/16 linfonodi repertati.
2) Le basi molecolari degli eventi descritti, tenendo conto di tutti i sintomi ed utilizzando i link alle informazioni pertinenti
La patogenesi del melanoma, come di tutte le altre forme di neoplasie maligne, è basata sull’acquisizione di alterazioni sequenziali a carico di specifiche regioni di DNA e/o di particolari meccanismi coinvolti nella regolazione del funzionamento cellulare.
Ad oggi, i seguenti geni, ed i pathway da essi dipendenti, sono stati dimostrati giocare un ruolo cruciale nella patogenesi del melanoma: CDKN2A (p16CDKN2A-CDK4-RB e p14CDKN2A-MDM2-p53 pathway), NRAS-BRAF (MAPK e PI3K-AKT pathway), cKIT e MITF.
CDKN2A
Il gene Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 2A (CDKN2A) svolge un ruolo fondamentale sia nella suscettibilità sia nella patogenesi del melanoma. Esso è localizzato sul cromosoma 9p21 e codifica per due proteine: p16CDKN2A e p14CDKN2A.
Il gene CDKN2A è un oncosoppressore ed agisce con un meccanismo d’azione di tipo recessivo; pertanto, è necessaria l’inattivazione di entrambi gli alleli per lo sviluppo del melanoma. In particolare, mutazioni di questo gene sono 7-10 volte più frequenti nei pazienti con una forte storia di ricorrenza familiare di melanoma (tre o più membri della famiglia affetti), rispetto alla stragrande maggioranza (circa il 90%) di pazienti con malattia classificata come sporadica. Nei pazienti con familiarità, circa il 40% dei probandi può risultare portatore di una mutazione germinale di CDKN2A, con prevalenze che variano notevolmente nelle differenti popolazioni e nelle diverse aree geografiche. Nei pazienti sporadici, il gene può risultare inattivo a livello somatico fino al 70% dei casi.
In condizioni fisiologiche, p16CDKN2A inibisce il sistema di protein-chinasi Cyclin-Dependent Kinase 4 (CDK4)/Cyclin D1 (CCND1), che, a sua volta, inibisce l’attività antiproliferativa della proteina RB (retinoblastoma-susceptibility) e permette la progressione nel ciclo cellulare (Figura 1). Nel melanoma, alterazioni del pathway p16CDKN2A-CDK4-RB sono correlate alla progressione della malattia; assenti nei nevi, cominciano a manifestarsi nei tumori primari, fino ad aumentare nei melanomi metastatici e nelle linee cellulari di melanoma. Le due principali alterazioni riscontrate a carico di tale pathway sono l’inattivazione di p16CDKN2A e l’amplificazione di CCND1: la prima è dovuta a meccanismi genetici (mutazioni geniche, riarrangiamenti cromosomici) od epigenetici (metilazione di regioni promotrici), mentre la seconda si riscontra generalmente nei melanomi negativi per mutazioni nei geni BRAF e NRAS, che principalmente insorgono nelle mucose e nelle aree cutanee cronicamente esposte al sole. In una piccola frazione di melanomi metastatici (circa 15% dei casi), è stata tuttavia dimostrata la coesistenza di amplificazione di CCND1 e mutazioni del gene BRAF, che sembra conferire resistenza alla terapia con inibitori di BRAF.
Analogamente, p14CDKN2A interferisce con le proteine Murine Double Minute 2 (MDM2) e p53, prevenendo la degradazione di quest’ultima e favorendo il suo controllo della progressione del ciclo cellulare; l’incremento del livello di espressione di p53 in risposta ad un danno genotossico previene infatti la divisione cellulare ed induce l’apoptosi. Nel melanoma, la riduzione dei livelli della proteina p53 contribuisce ad aumentarne l’aggressività e la refrattarietà alla terapia; l’inattivazione di p53 può essere dovuta a mutazioni di p14CDKN2Ao ad aumentata espressione di MDM2 o, in alternativa, al silenziamento del gene TP53 (principalmente, mediante un meccanismo funzionale epigenetico; la frequenza di mutazioni in tale gene è molto bassa).
NRAS-BRAF
RAS e BRAF sono due importanti molecole che mediano la risposta delle cellule agli stimoli mitotici extracellulari e giocano un ruolo centrale nella regolazione della crescita, sopravvivenza e proliferazione cellulare.
I prodotti della famiglia dei geni RAS, piccole proteine legate alla membrana citoplasmatica, sono costituiti da 3 isoforme tessuto-specifiche: HRAS, KRAS e NRAS. Le mutazioni di NRAS sono quelle maggiormente riscontrate nel melanoma (nel 15-30% dei casi). La stimolazione oncogenica di NRAS è in grado di attivare specifiche proteine citoplasmatiche con funzione chinasica poste a valle: RAF e Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K).
La famiglia di chinasi RAF consiste di tre proteine (ARAF, BRAF e CRAF), che fanno tutte parte della cascata di trasduzione del segnale nominata Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pathway. Nei melanociti, BRAF induce l’attivazione della chinasi MEK, la quale, a sua volta, attiva ERK, che costituisce l’effettore finale della cascata MAPK. Nel melanoma, il gene BRAF risulta mutato nel 40-60% dei casi; la mutazione prevalente (circa il 90% dei casi) è rappresentata dalla sostituzione di una valina con acido glutammico al codone 600 (V600EBRAF). La variante V600EBRAF, come le restanti mutazioni a carico della regione chinasica di BRAF, inducono, attraverso la fosforilazione (attivante) di ERK, una continua stimolazione della proliferazione cellulare e della crescita tumorale. Tuttavia, la dimostrazione che BRAF è mutato anche nei nevi comuni suggerisce che la sua attivazione oncogenica sia una condizione necessaria, ma non sufficiente, per lo sviluppo del melanoma.
Nei melanociti nevici, la presenza di mutazioni di BRAF è in grado di stimolare l’aumento di espressione di p16CDKN2A (con normali livelli di p14ARF), con conseguente induzione dei meccanismi di senescenza cellulare ed arresto del ciclo cellulare. Questo fenomeno appare come una reazione "protettiva", in risposta a tale inappropriato segnale mitogeno . A conferma dell’importanza di questo equilibrio funzionale, l’espressione di p16CDKN2A risulta ridotta od assente in circa 1/3 dei melanomi con mutazione V600EBRAF. Analogamente, l’attivazione oncogenica di BRAF è in grado di promuovere significativamente la trasformazione maligna di melanociti carenti in p53. Tutto questo conferma che BRAF mutato coopera con membri di entrambi i pathway di CDKN2A (p16CDKN2A e p53).
I melanomi che insorgono in aree cutanee esposte in maniera intermittente al sole e che, quindi, non rappresentano i segni di un danno solare cronico, presentano la più alta frequenza di mutazioni del gene BRAF . Si può ipotizzare che i raggi ultravioletti siano in grado di indurre tali mutazioni oncogeniche solo se l’esposizione solare non è sufficientemente prolungata da causare i cambiamenti tessutali tipici dell’esposizione cronica al sole. Recentemente, è stato dimostrato che alcune varianti genetiche del recettore di membrana Melanocortin-1 Receptor (MC1R) non sono in grado di stimolare adeguatamente la produzione della melanina capace di proteggere la pelle dai danni dei raggi ultravioletti . La combinazione tra la presenza di tali varianti di MC1R e l’esposizione intermittente ai raggi ultravioletti solari (i quali sembrano determinare un incremento della produzione di radicali liberi a livello cutaneo) è considerata responsabile dell’attivazione oncogenica di BRAF, attraverso un aumento indotto dei livelli intracellulari di AMP ciclico.
A rendere ulteriormente complesso tale scenario è l’osservazione che, in presenza di mutazioni del gene NRAS, che sono state dimostrate essere mutuamente esclusive con le mutazioni del gene BRAF , la traduzione del segnale mitogeno nell’ambito del MAPK pathway è dirottato su CRAF, che pertanto viene ad acquisire un ruolo chiave nel mantenimento della stimolazione della proliferazione cellulare in questo sottogruppo di melanomi . Infatti, un aumentato livello di espressione di CRAF è responsabile dell’acquisizione di resistenza alla terapia con inibitori di BRAF. Questi dati hanno pertanto implicazioni nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche basate sulla combinazione di trattamenti inibenti simultaneamente BRAF e CRAF ovvero BRAF e PI3K, l’altro pathway attivato da NRAS mutato .
PI3K
Oltre a MAPK, il secondo sistema di regolazione della crescita cellulare, prevalentemente dipendente da RAS attivato , è costituito dal pathway incentrato sulla proteina PI3K e costituito dalla cascata di trasduzione del segnale delle proteine PTEN, PI3K e AKT (in particolare, l’isoforma AKT3 nel melanoma).
In condizioni fisiologiche, l’attività fosfatasica della proteina PTEN riduce il livello intracellulare dei fosfoinositoli PIP2 e PIP3 prodotti dall’attivazione di PIK3 . Quest’ultima determina infatti un aumento dei livelli intracellulari di PIP3 che vanno ad attivare AKT e, di conseguenza, il suo substrato mTOR, il quale è deputato a modulare la sintesi di proteine coinvolte nella sopravvivenza e crescita cellulare nonché nell’apoptosi. Nel melanoma, il gene PTEN è deleto nel 30-40% dei casi sporadici (con perdita della corrispondente proteina nel 5-20% dei melanomi primari) e nel 30-50% delle linee cellulari . Aumentata espressione di AKT3 è presente nel 50% dei nevi displastici, nel 70% dei melanomi primari e nel 70% delle metastasi . L’attivazione di AKT: a) promuove la proliferazione cellulare attraverso l’induzione e la stabilizzazione di CCND1; b) inibisce l’apoptosi mediante l’inattivazione di molte proteine ad attività pro-apoptotica, quali BAD (antagonista di BCL-2, che invece ostacola i meccanismi di morte cellulare) e MDM2 (che causa la degradazione di p53. Riassumendo, l’effetto combinato della perdita di PTEN e dell’attivazione del sistema PI3K-AKT, che si verifica nel melanoma, risulta in una crescita aberrante delle cellule neoplastiche, con acquisizione di resistenza all’apoptosi e, quindi, di refrattarietà al trattamento chemioterapico.
MITF
Tra i prodotti genici che operano a valle del pathway di trasduzione del segnale BRAF-MEK-ERK, il più rilevante nel melanoma è rappresentato dal Microphthalmia-associated Transcription Factor (MITF) . In aggiunta al suo coinvolgimento nella pigmentazione cutanea, MITF sembra giocare un ruolo di primaria importanza nella proliferazione e differenziazione dei melanociti .
Il meccanismo d’azione di MITF è tuttavia alquanto complesso: una bassa od assente espressione di tale proteina predispone la cellula all’apoptosi; livelli intermedi di espressione di MITF promuovono la proliferazione e la sopravvivenza cellulare; elevate quantità di MITF all’interno della cellula producono un effetto antiproliferativo . Nel melanoma, si sono probabilmente sviluppate strategie per mantenere i livelli intracellulari della proteina MITF in un range compatibile con gli altri meccanismi di tumorigenesi. A conferma di ciò, è stato dimostrato che l’attivazione costitutiva di ERK, stimolata da mutazioni oncogeniche di BRAF, risulta associata ad una marcata degradazione di MITF. E’ stato pertanto ipotizzato che l’attivazione oncogenica di BRAF sia in grado di controllare i livelli intracellulari di MITF attraverso un fine bilanciamento di due meccanismi opposti: una riduzione diretta dei livelli di MITF mediante stimolazione della sua degradazione ed un aumento indiretto della quantità di tale proteina mediante attivazione di un fattore di trascrizione (BRN2), il quale, a sua volta, stimola l’espressione di MITF. Analogamente, nelle cellule di melanoma MITF interagisce con numerosi effettori che svolgono azioni contrapposte, quali CDK2 e BCL-2, che promuovono la progressione del ciclo cellulare e la riduzione dell’apoptosi, favorendo la proliferazione neoplastica, ovvero p21 e p16CDKN2A, che invece inducono l’arresto del ciclo cellulare e l’attivazione dei meccanismi di senescenza cellulare.
Bassi livelli intracellulari della proteina MITF sono stati riscontrati nei melanomi invasivi e sono stati associati ad una peggiore prognosi ed alla progressione clinica di malattia . L’amplificazione del gene MITF è stata osservata in circa il 15-20% dei melanomi metastatici portatori di mutazioni di BRAF. Tale fenomeno potrebbe essere dovuto ad una sorta di bilanciamento funzionale in risposta alla riduzione dei livelli della proteina indotta da BRAF mutato e la sua presenza è associata ad aumento della resistenza alla chemioterapia .
c-KIT
c-KIT è il recettore tirosin-chinasico per lo stem cell factor, che nei melanociti regola migrazione e sopravvivenza cellulare. Sebbene subisca frequentemente perdita di espressione nei melanomi, particolari alterazioni del recettore sono coinvolte nella patogenesi di alcuni sottogruppi di queste neoplasie. Anche se complessivamente meno frequenti delle mutazioni di BRAF e NRAS, specifiche variazioni di sequenza del gene c-KIT causano attivazione costitutiva del dominio chinasico, risultando in un’induzione continua della proliferazione cellulare, attraverso la stimolazione del MAPK pathway.
Le mutazioni di c-KIT sono state descritte nei melanomi acrali (10% dei casi), mucosali (15-20% dei casi) ed insorti nelle aree cutanee cronicamente esposte al sole (5% dei casi) .
In aggiunta alle mutazioni, si osservano anche amplificazioni geniche di c-KIT; infatti, circa 1/3 di melanomi con cKIT mutato presentano un aumento del numero di copie geniche . Considerando insieme entrambe le alterazioni (mutazioni ed amplificazioni), circa 1/4 di melanomi delle mucose ed acrali sono caratterizzati dalla presenza di un’aberrazione genomica di c-KIT . Non è stata descritta una marcata coesistenza di mutazioni di BRAF o NRAS ed alterazioni di c-KIT.
si possono così raggruppare le principali alterazioni molecolari patogenetiche:
- mutazioni oncogeniche del gene BRAF, i riarrangiamenti (rappresentati principalmente dalle delezioni alleliche) del cromosoma 9p21 e l’aumento dell’espressione proteica di AKT3 sono coinvolte nella fase di stimolazione della proliferazione dei melanociti (fase iniziale pre-neoplastica);
- alterazioni che causano disfunzione dei meccanismi di controllo della senescenza cellulare e di quelli che regolano l’apoptosi e la sopravvivenza cellulare (che vedono particolarmente coinvolti gli effettori dei pathway dipendenti da CDKN2A: deficit funzionale di p16CDKN2A, amplificazione di CCND1, inattivazione di TP53 attraverso una deregolazione del sistema p14CDKN2A-MDM2-p53), le mutazioni attivanti NRAS e le aberrazioni di c-KIT sono coinvolte nella fase di trasformazione neoplastica che porta allo sviluppo del melanoma (fase intermedia neoplastica);
- silenziamento genico di p16CDKN2A, la perdita funzionale di PTEN, l’attivazione del sistema PI3K-AKT e l’amplificazione del gene MITF sono coinvolte nella fase di acquisizione di un fenotipo maggiormente maligno ed aggressivo che porta alla progressione del melanoma (fase finale metastatica).
L’insieme di tali informazioni è fortemente indicativa dell’esistenza di complessi meccanismi molecolari di regolazione, che provvedono a garantire l’integrità e la regolarità delle diverse funzioni cellulari nei melanociti normali. La progressione dai melanociti normali a quelli trasformati in senso maligno, fino ad arrivare alla formazione delle cellule aggressive metastatiche, è pertanto il risultato della stretta combinazione di alterazioni, aumento o riduzione, dell’attività degli effettori che agiscono nei vari pathway molecolari.
E’ stato così sviluppato un modello di melanomagenesi di tipo lineare, basato sull’accumulo progressivo delle alterazioni molecolari descritte in precedenza.
Recentemente, si è tuttavia ipotizzata l’esistenza, in un numero non ancora quantificato di casi, di una seconda via di trasformazione neoplastica melanocitaria (di tipo "non lineare"), che vede il coinvolgimento di cellule staminali tessutali, le cui alterazioni darebbero direttamente origine a cellule di melanoma in fase di crescita superficiale oppure verticale ovvero, addirittura, in fase metastatica .
Questa seconda ipotesi si basa sull’evidenza di alcune incongruenze del modello di tumorigenesi progressiva in alcuni sottogruppi di melanomi, quali una maggiore incidenza di mutazioni BRAF nei melanomi a crescita verticale rispetto a quelli a crescita superficiale, nonché l’osservazione di amplificazioni delle regioni genomiche 9p21 e 1p22 in maniera prevalente nei melanomi nodulari .
3) Eventuali proposte di terapia, volta al ripristino delle condizioni ottimali
Chemioterapia a base di Deticene e Fotemustina, Immunoterapia con Ipilibuman e Radioterapia.
Radioterapia palliativa di 20Gy.
Spunti critici:
Approccio multidisciplinare: dermatologo, senologo, chirurgo, radiologo, anatomopatologo, biologo molecolare, radioterapista, oncologo, psicologo.
Diventa anche evidente che una più approfondita conoscenza dei bersagli molecolari consente di identificare marcatori in grado di predire sia la prognosi (valore prognostico) sia la risposta terapeutica a specifici trattamenti (valore predittivo), nei pazienti con melanoma. In questo ultimo caso, è ormai chiaro che l’introduzione di composti antitumorali mirati su bersagli genici in combinazione con le terapie convenzionali rende necessaria una più appropriata selezione dei pazienti da indirizzare ai vari trattamenti innovativi. E’ infatti alquanto improbabile che l’attuazione di una terapia mirata contro un componente dei pathway molecolari patogenetici possa produrre una significativa risposta antitumorale in pazienti non selezionati per alterazioni in quello specifico bersaglio. Per tali motivi, la classificazione molecolare sarà sempre più parte integrante della diagnosi e stadiazione dei pazienti con melanoma fornendo informazioni insostituibili per la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici.
