Ruolo degli anticorpi anti-Aquaporina 4 nella diagnosi della Neuromielite Ottica.
La Neuromielite Ottica (NMO) è una patologia infiammatoria demielinizzante del sistema nervoso centrale (SNC) che colpisce prevalentemente i nervi ottici e il midollo spinale. Per tutto il ventesimo secolo la NMO fu considerata una sindrome monofasica severa caratterizzata da neurite ottica bilaterale e mielite che si presentano in rapida successione. Studi successivi inclusero anche pazienti che manifestavano attacchi clinici meno gravi, neurite ottica unilaterale e sintomi distanziati anche mesi o anni l’uno dall’altro. Si accese così il dibattito sulla possibilità di considerare la NMO come una patologia a se’ stante o come una variante della Sclerosi Multipla (SM), e se pazienti con una patologia ricorrente (non monofasica) potessero rientrare nei criteri diagnostici di NMO. Dal momento che in quegli anni prendeva piede la definizione di SM come una “patologia disseminata nel tempo e nello spazio”, anche la NMO venne considerata una forma di Sclerosi Multipla.
Una serie di studi sia clinici sia immunologici condotti recentamente hanno però fatto cambiare l’opinione medica, che oggi considera la Neuromielite Ottica come una patologia distinta dalla SM. In primo luogo, a differenza della SM, nella maggior parte dei pazienti la NMO non si associa a lesioni encefaliche all’esordio, anche se poi tali lesioni possono camparire nel tempo. In secondo luogo, una serie di studi clinici condotti negli ultimi 10 anni hanno dimostrato come molti pazienti con NMO manifestino una mielite trasversa estesa longitudinalmente (LETM), definita mediante risonanza magnetica come una lesione del midollo che si estende lungo almeno 3 segmenti vertebrali contigui: tale lesione è estremamente rara in pazienti con SM. Inoltre, studi neuropatologici dimostrano che, nonostante vi sia demielinizzazione, la NMO è caratterizzata da una patologia vasculocentrica tipica con evidenti depositi perivascolari di immunoglobuline e l’attivazione del pathway litico del complemento, che suggeriscono la partecipazione delle cellule B nel processo della malattia. Infine, è stato scoperto un autoanticorpo altamente specifico (NMO-IgG) presente nel siero di pazienti con NMO, ma assente nel siero di pazienti con SM o con altre patologie infiammatorie caratterizzate da neuropatie ottiche o mielopatie (Lennon 2004). Nel 2005 il guppo di Lennon ha dimostrato che la NMO-IgG riconosce in modo specifico l’Aquaporina 4 (AQP4), il più abbondante canale dell’acqua presente nel sistema nervoso centrale, rendendo così la NMO la prima patologia infiammatoria demielinizzante del SNC ad avere un autoantigene conosciuto. Questi dati ottenuti da studi clinici, radiologici, patologici ed immunologici supportano l’evidenza che la NMO sia una patologia distinta dalla SM, che oggi può essere diagnosticata attraverso un test di laboratorio che prevede la valutazione della presenza della NMO-IgG nel siero dei pazienti e il dosaggio degli anticorpi anti-AQP4. Ad oggi sono state descritte alcune metodiche per la valutazione della NMO-IgG e per il dosaggio di anticorpi anti-AQP4, ma non esiste ancora un test validato e standardizzato. La valutazione della presenza della NMO-IgG viene effettuata mediante una metodica di immunofluorescenza indiretta su sezioni di cervello o cervelletto di topo (Lennon et al. 2004): è stato identificato un pattern tipico della NMO-IgG, che si lega a strutture adiacenti ai piccoli vasi della sostanza bianca e grigia del cervelletto, del mesencefalo e del midollo. Questa metodica consente di distinguere pazienti con NMO da pazienti con SM con una sensibilità del 73% ed una specificità del 91%. La produzione di una linea cellulare transfettata in modo stabile con AQP4 (HEK 293 T) ha permesso di settare una metodica di immunofluorescenza indiretta per la valutazione degli anticorpi anti-AQP4, incrementando sensibilità e specificità del test diagnostico (85% e 100% rispettivamente).
Nel nostro laboratorio abbiamo messo a punto una metodica di Western Blot su lisato totale di rene e cervello di topo per la valutazione della presenza di anticorpi anti-AQP4 nel siero dei pazienti (sensibilità: 83%, specificità: 92%); per confermare la specificità dell’anticorpo per l’antigene AQP4, abbiamo immunoprecipitato l’aquaporina 4 da rene di topo e utilizzato questa proteina in un western blot con il siero dei pazienti, incrementando così ulteriormente la specificità del nostro test diagnostico (100%). Gli stessi esperimenti sono stati effettuati anche sulle cellule HEK 293 T transfettate con AQP4 (risultati in corso).
Il western blot in seguito a immunoprecipitazione di AQP4 (da rene di topo o da cellule HEK 293 T) sembra essere un buon test per la diagnosi di NMO, in termini sia di sensibilità e specificità, sia di ripetibilità ed affidabilità, sia di semplicità di esecuzione.
INTRODUZIONE:
- la NMO: (Epidemiologia, Genetica, Clinica, Immunologia)
- Scoperta della NMO-IgG e anticorpi anti-AQP4: ruolo diagnostico
SCOPO DEL LAVORO:
Messa a punto di un nuovo test diagnostico per la NMO. Valutazione degli anticorpi anti-AQP4 nel siero dei pazienti attraverso una metodica di western blot ed immunoprecipitazione.
PAZIENTI E METODI: descrizione dettagliata delle metodiche
RISULTATI:
- analisi di espressione di AQP4 in diversi tessuti
- sensibilità e specificità del Western Blot ed Immunoprecipitazione su diversi tessuti
- analisi di ripetibilità e affidabilità del test
- confronto dei diversi tessuti utilizzati per valutare la metodica migliore
CONCLUSIONI:
Il western blot in seguito a immunoprecipitazione di AQP4 (da rene di topo o da cellule HEK 293 T) sembra essere un buon test per la diagnosi di NMO: dimostra infatti elevate sensibilità e specificità, buone ripetibilità ed affidabilità, e risulta di semplice esecuzione.
