Multiple Sclerosis
Diseases

Transferrin and thyroid hormone converge in the control of myelinogenesis, 2015

Analysis of immune-related loci identifies 48 new susceptibility variants for multiple sclerosis, 2013

Italiani fanno luce su guaina nervi, nuova speranza contro sclerosi multipla

Roma, 13 giu. (Adnkronos Salute) - La ricerca italiana mette a segno un altro colpo vincente. I ricercatori del San Raffaele di Milano, in collaborazione con la New York University e l'Hospital for Special Surgery di New York, hanno scoperto un nuovo meccanismo che regola la formazione della mielina, membrana che avvolge le fibre nervose nel sistema nervoso centrale e periferico. La scoperta del meccanismo di funzionamento dell'interruttore della guaina mielinica apre nuovi scenari per la cura di malattie come la sclerosi multipla, patologia altamente invalidante che colpisce circa 400 mila persone in Europa, principalmente donne. Sarà infatti possibile, in futuro, sviluppare un trattamento che favorisca la formazione di questa guaina in quei pazienti che l'hanno persa a causa d'infezione, danno, o per difetti genetici.La ricerca, pubblicata sulla rivista 'Nature Neuroscience', è stata resa possibile grazie al programma borsa di Ricerca Senior 'Rita Levi Montalcini' della Fism (Fondazione italiana sclerosi multipla). Per poter procedere con questo tipo di studio, è stato creato presso l'Inspe (Istituto di neurologia sperimentale), diretto da Giancarlo Comi dell'ospedale San Raffaele di Milano, un nuovo laboratorio (Axo-Glial), il primo finanziato dall'Associazione italiana sclerosi multipla (Aism) e dalla sua Fondazione e interamente dedicato allo studio dei processi di demielizzazione e remielizzazione, fondamentali nella patogenesi della sclerosi multipla. Il nuovo laboratorio è diretto da Carla Taveggia, prima assegnataria nel 2007 della borsa 'Rita Levi Montalcini-Costruire una carriera'.La mielina, nota anche come 'sostanza bianca' del sistema nervoso, è una membrana altamente specializzata che avvolge le fibre nervose nel sistema nervoso centrale e periferico ed è necessaria per una rapida conduzione dell'impulso nervoso. La conduzione dell'impulso nervoso di nervi mielinizzati - spiegano i ricercatori del San Raffaele - è infatti circa 100 volte più veloce di quella di nervi non mielinizzati. La formazione della guaina mielinica è strettamente controllata e la sua assenza o la sua degenerazione può avere un impatto rilevante sulla qualità di vita dei pazienti e, nei casi più severi, accorciarne anche l'aspettativa di vita. Malattie della mielina possono essere di origine genetica, come nel caso di neuropatie periferiche ereditarie o di severe forme di leucodistrofia del sistema nervoso centrale. Il principale obiettivo dei ricercatori è stato quello d'identificare i meccanismi di base che regolano la formazione della guaina mielinica e il loro ruolo nella patogenesi di malattie demielinizzanti, poiché alterazioni nel grado di mielinizzazione possono avere conseguenze significative che vanno dalla perdita di conduzione dell'impulso nervoso fino alla morte neuronale e quindi portare ad una invalidità permanente. In studi precedenti gli stessi studiosi avevano individuato un fattore di crescita della guaina mielinica: la neuregulina 1 di tipo III. Si è visto che la neuregulina agisce da interruttore generale della mielinizzazione e determina la quantità di mielina che viene formata attorno ai nervi.Questo studio è un ulteriore passo avanti, poiché si è cercato di capire come l'attività del fattore di crescita fosse regolata durante la mielinizzazione e si è identificata una nuova molecola, Tace (Tumor necrosis factor alpha-converting enzyme) che, agendo sulla neuregulina 1 di tipo III, è in grado di modularne l'attività e il funzionamento. La ricerca dimostra che Tace taglia la neuregulina 1 di tipo III e la inattiva: Tace, agendo sull'attività della Neuregulina 1 di tipo III, blocca la mielinizzazione ed è quindi un modulatore dei processi di formazione della guaina mielinica. Questo studio descrive il primo meccanismo di regolazione negativa della mielinizzazione e soprattutto chiarisce i processi fondamentali che regolano l'espressione della neuregulina 1."In pratica - spiegano dal San Raffaele - la ricerca ha dimostrato il ruolo fondamentale di Tace per la mielinizzazione; il fatto che la sua attività può essere aumentata o diminuita usando dei farmaci che sono già in uso in sperimentazioni cliniche ci consentirà di modulare la quantità di mielina formata attorno ai nervi. Questi studi sono fondamentali per ripristinare la formazione della mielina attorno a nervi che l'hanno persa". "Ciò che abbiamo scoperto - spiega Carla Taveggia, responsabile dell'Unità interazioni Axo-Gliali dell'Istituto di neurologia sperimentale del San Raffaele di Milano e coordinatrice dello studio - è il primo meccanismo che blocca la formazione della guaina mielinica. I farmaci attualmente in uso per curare la sclerosi multipla e le altre malattie demielinizzanti, non sono in grado di bloccare la malattia, ma nel migliore dei casi solo di rallentarla. Riuscire perciò a capire come funziona l'interruttore generale della mielinizzazione è essenziale per sviluppare un processo che favorisca la formazione della mielina attorno a nervi che l'hanno persa".Soddisfatto del risultato della ricerca anche il presidente della Fondazione italiana sclerosi multipla, Mario Alberto Battaglia: "Il nostro impegno da oltre 40 anni - afferma - è quello di indirizzare, promuovere e finanziare la ricerca scientifica in aree prioritarie quali lo studio dei meccanismi che regolano la formazione della mielina e che sono specialmente compromessi nelle forme progressive della sclerosi multipla. E' in questo contesto scientifico - conclude - che abbiamo finanziato il nuovo laboratorio Axo-Glial, per supportare la dottoressa Taveggia nello sviluppo ulteriore di questo importante risultato verso una comprensione delle cause della malattia e terapie innovative".

Ms and d-dimer

Chlamydia pneumoniae

Recentemente e' stata trovata C. pneumoniae nel LCS di pazienti affetti da SM.

Molecular detection of Parachlamydia-like organisms in cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis

Multiple sclerosis: an infectious syndrome involving Chlamydophila pneumoniae

Chlamydia pneumoniae and the risk for exacerbation in multiple sclerosis patients

Chlamydia pneumoniae and the risk for exacerbation in multiple sclerosis patients, data

Mycobacterium smegmatis

Mycobacterium smegmatis expressing a chimeric protein MPT64-proteolipid protein (PLP) 139-151 reorganizes the PLP-specific T cell repertoire favoring a CD8-mediated response and induces a relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. 2010

Neurologia e Centro Neurologico Terapia Sperimentale Ospedale S. Andrea - Università degli Studi di Roma “La Sapienza”

Sm, ok a metilprednisolone orale e intravena
Terapie con metilprednisolone orale (oMP) risulterebbero efficaci al pari di quelle con metilprednisolone IV (IV MP) nella riduzione di specifiche lesioni in pazienti con sclerosi multipla (Sm). A ribadirlo è uno studio pubblicato su Neurology da un gruppo di ricerca coordinato da Massimo Filippi dell'Ospedale San Raffaele di Milano, che ha inoltre consentito di evidenziare profili di sicurezza e di tollerabilità assolutamente simili tra i due farmaci. In particolare, gli autori hanno dimostrato che, in seguito a riacutizzazione della malattia, l'impiego di dosi uguali di oMP e IV MP, l'uno somministrato oralmente l'altro endovena, determina un decremento paragonabile delle lesioni captanti il gadolinio per un periodo di una settimana. In particolare, 40 individui con Sm sono stati randomizzati a ricevere, per cinque giorni, un grammo al giorno di oMP oppure di IV MP. Dopo quattro settimane, i due gruppi di pazienti hanno mostrato lo stesso miglioramento dell'indice Edss (Expanded Disability Status Scale). In aggiunta, entrambi i trattamenti sono stati ben tollerati e hanno fatto registrare pochi eventi avversi. (L.A.)

Neurology. 2009 Dec 1;73(22):1842-8

Diagnosi più accurate di sclerosi multipla
Test neurologici e tecniche di risonanza magnetica (Mri) possono risultare di notevole vantaggio nella predizione dell'evoluzione a breve termine di forme benigne di sclerosi multipla (Sm). È quanto sottolineato da Maria Pia Amato, ricercatrice presso il Dipartimento di Neurologia dell'Università di Firenze e coordinatrice dello studio pubblicato su Neurology. La ricerca ha coinvolto 63 pazienti affetti, da circa 15 anni, da forme lievi di Sm, ossia classificabili con score pari o inferiore a 3, secondo la scala di valutazione Edss (Expanded disability status scale). Dopo circa 5 anni di osservazione, per i pazienti in cui lo score è rimasto di valore inferiore a 3 è stata confermata la diagnosi di Sm benigna, mentre nel caso in cui la malattia abbia subito un peggioramento, raggiungendo uno score pari o superiore a 4, si è parlato di "forme non più benigne" di Sm. Queste forme sono state identificate con un'accuratezza dell'82%, grazie a un modello di valutazione, che prevedeva l'utilizzo di 3 variabili, quali sesso maschile, numero di test neurologici falliti e immagini T1 di lesioni cerebrali. "Specifiche valutazioni cognitive e indagini Mri potranno, da questo momento, permetterci di classificare con maggiore precisione le forme benigne di Sm, attraverso la definizione dei danni presenti a livello cerebrale" ha dichiarato Amato. (L.A.)

Neurology 2009; 73:495-503.

Riparare la mielina: istruzioni per l’uso

La scoperta di un meccanismo chiave per la riparazione della mielina potrebbe portare alla messa a punto di nuove terapie. I ricercatori dell’Università del New Jersey hanno studiato come l’organismo, nelle forme a ricadute e remissioni, ricostruisce il rivestimento gliale distrutto durante le fasi attive. Hanno così individuato che a dirigere il processo di rigenerazione degli oligodendrociti produttori di mielina è il target della rapamicina nei mammiferi, in sigla mTOR (mammalian target of rapamycin). «Non sappiamo ancora però se per indurre l’organismo a riparare il danno basterà attivare questa via, oppure se ci sono altri impedimenti ambientali, per esempio il processo infiammatorio in atto, a impedire la sua normale funzione» ha messo le mani avanti Teresa L. Wood, docente al Department of Neurology and Neurosciences dell’ateneo del New Jersey e titolare di una cattedra specifica in sclerosi multipla, che ha coordinato il lavoro.
Fonte: J Neuroscience 2009; 29: 6367

Transcriptional analysis of targets in multiple sclerosis 2003

Pedotti Rosetta and the role of histamine in multiple sclerosis

Deficiencies of polyunsaturated fatty acids and replacement by nonessential fatty acids in plasma lipids in multiple sclerosis. 1989

CIITA nell'immunodefienza congenite 2004

Cartoon of therapeutical approaches

Hypothetical molecular mechanisms by which local iron overload facilitates the development of venous leg ulcers and multiple sclerosis lesions. 2008

Basic Myelin Protein molecular mimicry

cross-reactivity with bacterial antigens: none

cross-reactivity with viral antigens

>GBVRL:62467902_62467903 attachment glycoprotein [Human
metapneumovirus] AAX84055.1 [AY848866]
Length = 215

Score = 36.6 bits (83), Expect = 0.19
Identities = 26/86 (30%), Positives = 38/86 (44%), Gaps = 7/86 (8%)

Query: 8 RELNAEKASTNSETNRGESEKKRNLGELSRTTSEDNEVFGEADANQNNGTSSQDTAVTDS 67
R N + T +E + K RTTS + N N TS A T S
Sbjct: 115 RSINRQTTQTTTEKKPTGATTKKEKETTTRTTS----IAATQTPNTTNQTSNGREATTTS 170

Query: 68 KRT---ADPKNAWQDAHPADPGSRPH 90
R+ A N Q ADP S+PH
Sbjct: 171 ARSKNGATTQNSDQTTQAADPSSKPH 196

>GBVRL:187969135_187969136 gag protein [Simian foamy virus]
ACD44712.1 [EU527653]
Length = 204

Score = 35.0 bits (79), Expect = 0.56
Identities = 22/52 (42%), Positives = 30/52 (57%), Gaps = 6/52 (11%)

Query: 228 VTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFSWGAEG-----QRPGFGYGGRASDYKSAHKG 274
VTP+ P PS+G+GRG + SR S G QRP G R SD ++ ++G
Sbjct: 147 VTPQ-PRPSRGRGRGQNSSRPSQGPANSGRGRQRPASGQNERGSDTQNQNQG 197

Which is the prevalence of Human metapneumovirus as an etiological agent of acute respiratory infections? from 15% to 50% according to the areas

Papers Metapneumovirus prevalence

HHSV6

Enferm Infecc Microbiol Clin. 2000 May;18(5):223-8.Click here to read Links
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[Detection of viral genomes of the Herpesviridae family in multiple sclerosis patients by means of the polymerase chain reaction (PCR)]
[Article in Spanish]

Alvarez R, Cour I, Kanaan A, Benedicto M, Martín-Estefanía C, Arroyo R, Varela de Seijas E, Picazo JJ.

Servicio de Microbiología, Hospital Universitario San Carlos, Madrid.

BACKGROUND: The multiple sclerosis seems to be the junction between genetics alteration and an unknown environmental factor, that they would originate an autoimmune alteration, that they would be the reason of the inflammation and demyelinization responsible of the disease. Our objective has been the determination of this possible environmental factor and to reach it, we have studied the appearance of Herpesviridae family viruses. MATERIALS AND METHODS: 204 blood samples were studied: 102 from relapsing-remitting multiple sclerosis patients (43 were undergoing beta-interferon treatment), and 102 from blood donors with the same age and sex than multiple sclerosis patients. From this samples, we extracted the DNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and we analyzed by polymerase chain reaction (PCR) to detect the appearance of herpes simplex virus, varicella zoster virus, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, human herpesvirus 6 (HHV-6), human herpesvirus 7 and human herpesvirus 8. RESULTS: a) we only found significative difference (p = 0.0001) in HHV-6: 21.5% donors positive samples (22/102), opposite to 49.02% of positivity in mulytiple sclerosis patients (50/102); b) we didn't found significative differences in none of other viruses studied, between patients treated with beta-interferon and non-treated ones. CONCLUSIONS: Our results suggest us that HHV-6 can play an important role in the multiple sclerosis development. The beta-interferon treatment doesn't

Papers HHV 6 multiple sclerosis

J Neurovirol. 2006 Aug;12(4):284-93.
Efficacy of antiviral compounds in human herpesvirus-6-infected glial cells.
Akhyani N, Fotheringham J, Yao K, Rashti F, Jacobson S.

Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.
Abstract
The beta-herpesvirus human herpesvirus-6 (HHV-6) is becoming increasingly recognized as an important pathogen in immunocompromised patients, particularly in post bone marrow transplant (BMT). Reactivation of latent HHV-6 resulting in encephalitis has been reported in BMT and stem cell transplant (SCT) patients. The development of HHV-6 encephalitis can be a fatal complication, the frequency of which is increasing likely due to improved diagnosis with quantitative polymerase chain reaction (PCR) of cerebrospinal fluid. There are currently no antiviral compounds approved for HHV-6, nor have any controlled clinical trials been conducted. The frequency and severity of HHV-6 encephalitis in both immunocompetent and immunocompromised patients necessitates studies on the usefulness of currently available anti-viral compounds. The authors compared the antiviral efficacy of four drugs currently used for cytomegalovirus (CMV) infection, a beta-herpesvirus sharing homology with HHV-6. In HHV-6A- and HHV-6B-infected T cells, acyclovir, ganciclovir, foscarnet, and cidofovir exhibited antiviral activity consistent with that published in other studies. In HHV-6-infected human astrocytes (U251), however, only foscarnet and cidofovir exhibited antiviral activity and this effect was restricted to infection with HHV-6 variant A. In pathological brain sections from patients with neurological disorders such as multiple sclerosis and epilepsy, HHV-6 has been localized to glial cells. Determination of antiviral activity in human glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positive astrocytes of currently used antiviral compounds is essential for potential treatment of HHV-6 and neurological disorders. Our data highlight the necessity for further study of antiviral compound in HHV-6-infected glial cells as well as the development of more selective compounds for HHV-6.

Divergent susceptibilities of human herpesvirus 6 variants to type I interferons. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 4;107(18):8369-74. Epub 2010 Apr 19.
Jaworska J, Gravel A, Flamand L.

Department of Microbiology-Infectiology-Immunology, Axe Infectiologie et Immunologie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec Research Center, Laval University, Quebec, Canada.
Abstract
Two distinct human herpesvirus 6 (HHV-6) variants infect humans. HHV-6B is the etiologic agent of roseola and is associated with life-threatening neurological diseases, such as encephalitis, as well as organ transplant failure. The epidemiology and disease association for HHV-6A remain ill-defined. Specific anti-HHV-6 drugs do not exist and classic antiherpes drugs have secondary effects that are often problematic for transplant patients. Clinical trials using IFN were also performed with inconclusive results. We investigated the efficacy of type I IFN (alpha/beta) in controlling HHV-6 infection. We report that cells infected with laboratory strains and primary isolates of HHV-6B are resistant to IFN-alpha/beta antiviral actions as a result of improper IFN-stimulated gene (ISGs) expression. In contrast, HHV-6A-infected cells were responsive to IFN-alpha/beta with pronounced antiviral effects observed. Type II IFN (gamma)-signaling was unaltered in cells infected by either variant. The HHV-6B immediate-early 1 (IE1) physically interacts with STAT2 and sequestrates it to the nucleus. As a consequence, IE1B prevents the binding of ISGF3 to IFN-responsive gene promoters, resulting in ISG silencing. In comparison, HHV-6A and its associated IE1 protein displayed marginal ISG inhibitory activity relative to HHV-6B. The ISG inhibitory domain of IE1B mapped to a 41 amino acid region absent from IE1A. Transfer of this IE1B region resulted in a gain of function that conferred ISG inhibitory activity to IE1A. Our work is unique in demonstrating type I IFN signaling defects in HHV-6B-infected cells and highlights a major biological difference between HHV-6 variants.

J Clin Virol. 2010 May;48(1):55-7. Epub 2010 Mar 7.
Diagnostic assays for active infection with human herpesvirus 6 (HHV-6).
Caserta MT, Hall CB, Schnabel K, Lofthus G, Marino A, Shelley L, Yoo C, Carnahan J, Anderson L, Wang H.

Department of Pediatrics, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, NY 14642, United States. mary_caserta@urmc.rochester.edu
Abstract
BACKGROUND: Human herpesvirus 6 (HHV-6) causes ubiquitous infection in early childhood with lifelong latency or persistence. Reactivation of HHV-6 has been associated with multiple diseases including encephalitis. Chromosomal integration of HHV-6 also occurs. Previous studies have suggested that the detection of HHV-6 DNA in plasma is an accurate marker of active viral replication.

OBJECTIVE: We sought to determine whether PCR assays on plasma could correctly differentiate between primary HHV-6 infection, chromosomal integration of HHV-6 and latent HHV-6 infection.

STUDY DESIGN: We performed qualitative PCR, real-time quantitative PCR (RQ-PCR), and reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) assays on samples of peripheral and cord blood mononuclear cells, as well as plasma, from groups of subjects with well defined HHV-6 infection, including subjects with chromosomally integrated HHV-6.

RESULTS AND CONCLUSIONS: The detection of HHV-6 DNA in plasma was 92% sensitive compared to viral isolation for the identification of primary infection with HHV-6. All plasma samples from infants with chromosomally integrated HHV-6 had HHV-6 DNA detectable in plasma while only 5.6% were positive by RT-PCR. The specificity of plasma PCR for active replication of HHV-6 was 84% compared to viral culture while the specificity of RT-PCR was 98%. Our results demonstrate that qualitative or quantitative PCR of plasma is insufficient to distinguish between active viral replication and chromosomal integration with HHV-6. We found a higher specificity of RT-PCR performed on PBMC samples compared to PCR or RQ-PCR performed on plasma when evaluating samples for active HHV-6 replication.

J Clin Microbiol. 2002 Nov;40(11):4131-7.
Detection of antibodies directed against human herpesvirus 6 U94/REP in sera of patients affected by multiple sclerosis.
Caselli E, Boni M, Bracci A, Rotola A, Cermelli C, Castellazzi M, Di Luca D, Cassai E.

Section of Microbiology, Department of Experimental and Diagnostic Medicine. Section of Neurology, Department of Medical Surgical, Communication and Behavioral Sciences, University of Ferrara, Ferrara, Italy.
Abstract
The association between human herpesvirus 6 (HHV-6) and multiple sclerosis (MS) is controversial. In fact, it is difficult to establish a causative role of HHV-6, due to the high prevalence of latently infected individuals in the healthy population. Therefore, the presence of virus sequences in tissue biopsy does not support a viral role, and serological assays do not show significant differences between MS patients and control populations. The only viral gene expressed during latency is U94/rep. Therefore, we have developed a serological assay for the detection of antibodies specifically directed against U94/REP protein. Different populations were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay, including healthy controls, MS patients, and subjects with diseases unrelated to HHV-6 infection, including other neurological diseases. The results show statistically significant differences (P > 0.01) between MS patients and control groups, both in antibody prevalence (87 and 43.9%, respectively) and in geometric mean titer (1:515 and 1:190, respectively). The detection of antibodies specific for HHV-6 U94/REP shows that the immune system is exposed to this antigen during natural infection. The higher prevalence and higher titers of antibodies to U94/REP suggest that MS patients and control groups might experience different exposures to HHV-6.

Virology. 2006 Mar 15;346(2):402-14. Epub 2005 Dec 20.
Human herpesvirus 6 (HHV-6) U94/REP protein inhibits betaherpesvirus replication.. 2006 Mar 15;346(2):402-14. Epub 2005 Dec 20.
Human herpesvirus 6 (HHV-6) U94/REP protein inhibits betaherpesvirus replication.
Caselli E, Bracci A, Galvan M, Boni M, Rotola A, Bergamini C, Cermelli C, Dal Monte P, Gompels UA, Cassai E, Di Luca D.

Department of Experimental and Diagnostic Medicine, Section of Microbiology, University of Ferrara, Via Borsari 46, 44100 Ferrara, Italy.
Abstract
Human herpesvirus 6 (HHV-6) is the only human herpesvirus encoding U94/rep, homologue to the parvovirus non-structural gene rep68/78. Results to date suggest that HHV-6 U94/rep might regulate viral gene expression and have a role in viral latency. To determine the effect of U94/REP upon viral replication, the protein was produced. The purified U94/REP retained the characteristic immunological features. It was internalized and localized in the nucleus of human cells, showing marked inhibitory activity on the replication of HHV-6 (both variants A and B). The effect of U94/REP was dose-dependent and sensitive to treatment with single-stranded but not double-stranded DNA. U94/REP inhibited the replication of other betaherpesviruses, HHV-7 and human cytomegalovirus, but had no effect on herpes simplex virus. These results confirm the action of U94/rep latency gene in the regulation of HHV-6 replication with implications for co-reactivations and latency of human betaherpesviruses.
Caselli E, Bracci A, Galvan M, Boni M, Rotola A, Bergamini C, Cermelli C, Dal Monte P, Gompels UA, Cassai E, Di Luca D.

Department of Experimental and Diagnostic Medicine, Section of Microbiology, University of Ferrara, Via Borsari 46, 44100 Ferrara, Italy.
Abstract
Human herpesvirus 6 (HHV-6) is the only human herpesvirus encoding U94/rep, homologue to the parvovirus non-structural gene rep68/78. Results to date suggest that HHV-6 U94/rep might regulate viral gene expression and have a role in viral latency. To determine the effect of U94/REP upon viral replication, the protein was produced. The purified U94/REP retained the characteristic immunological features. It was internalized and localized in the nucleus of human cells, showing marked inhibitory activity on the replication of HHV-6 (both variants A and B). The effect of U94/REP was dose-dependent and sensitive to treatment with single-stranded but not double-stranded DNA. U94/REP inhibited the replication of other betaherpesviruses, HHV-7 and human cytomegalovirus, but had no effect on herpes simplex virus. These results confirm the action of U94/rep latency gene in the regulation of HHV-6 replication with implications for co-reactivations and latency of human betaherpesviruses.