G6PD Deficiency
Diseases

Elisa Ricciardi e Daniela Tomaiuolo

G6PD DEFICIENCY: MOLECULAR DIAGNOSIS

The G6PD gene was cloned in 1986 consists of 13 exons and 12 introns which are spread over a region of >100kb on the X chromosome. Therefore G6PD deficiency is an X-linked genetic defect in which most sufferers of the disease are male.

Currently approximately 193 mutations are well known, with respect to the number of circa 400 mutations identified. Most of the mutations of this gene are characterized by a single nucleotide substitution and they affect the coding region. Rarely also a second mutation in cis can be found, and even more uncommon are the small and big deletions.

Most of the 193 different mutations, identified to-date, are classified from Class I to Class IV ( WHO classification ), according to the severity/type of clinical manifestations:

• Class I : severe enzyme deficiency with chronic non-spherocytic haemolytic anaemia (CNSHA);
• Class II : severe enzyme deficiency with less than 10% of the normal activity;
• Class III : mild to moderate enzyme deficiency (10 to 60% of normal activity);
• Class IV : very mild or almost normal enzyme activity (>60% normal activity and no clinical problem).

Even though the enzymatic activity evaluation (biochemical diagnosis) can address to G6PD deficiency diagnosis, the definitive characterization of the mutation responsible of the enzymatic defect is able to complete and clarify the clinical picture. G6PD mutations are closely correlated to the geographical region, so it is possible to separate the test into two different level of analysis.

On the DNA sample a first level test is executed, aimed to research the most common mutations in Italy , via PCR and subsequent restriction analysis (RFLP).

Summary table of the most common Italian mutations

Right after PCR analysis, through the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), the presence of a mutation can be evaluated. A specific DNA fragment cutting is performed by restriction enzymes. Through the treatment of the target region with different restriction enzymes (MboII for Mediterranean, Hin1II* for A¯202 and Cassano, FokI for A¯376 and Dde I for Seattle) and then by analyzing the relative restriction pattern through electrophoresis, it is possible to identify the genotype of the analyzed region.

Nowadays among the diagnostic methods described above, in first level diagnosis the High Resolution Melting Analysis (HRMA) is also used. The first step consists on the amplification using real-time PCR, with the presence of a fluorophore. The analysis contemplates the exposure of the amplified DNA to temperature growing, with the record of the data concerning the transformation from double-stranded DNA (dsDNA) to single-stranded DNA (ssDNA). This allows, at the same time, to highlight also the increasing of DNA concentration subsequent to PCR, and to make visible the ds-DNA temperature dependent dissociation. The fluorescence emission after dsDNA denaturation is then analyzed via software . In order to find possible mutations taking place in the analyzed sequences, a study of existing variations between melting profiles and amplicons is needed. Heterozygous DNA creates hetero duplex, which start to dissociate at lower temperatures and with different profiles with respect to the homozygous DNA. When mutated samples are compared to wild type ones, all possible differences become clear. Hetero duplex are less stable than homo duplex and then they can dissociate easier. By comparing non-known samples with wild type samples, it is possible to put in evidence differences both in terms of melting profiles as well as temperature melting. The main advantage of this technique is the real time monitoring of the PCR exploiting the fluorescence emission from the fluoroforid which fitting itself into the dsDNA is able to create a plot reporting this information together with the temperature one. The amplicon melting temperature depends both on the length and the basis composition. This is the reason why the presence of a mutation in the amplified DNA region will change the melting temperature.

If the first level test is negative, in the case of a valid clinical reason and familiarity for G6PD deficiency, the second level genetic test is performed; this consists of direct sequencing of exon regions and of exon/intron junction's segment of the entire gene.

Sequencing allows to determine if the nucleotids sequence constituting the nucleic acid corresponds to the reference one reported in the genetic database. Sequencing metodology is based on the chain termination method, developed by Frederick Sanger, who employes modified nucleotids (Dideoxy nucleoside triphosphates ddNTPs)in order to interrupt the syntesis reaction in specific positions along the sequence. In sequencing reaction the extention is started in a specific DNA site, using a primer oligonucletide complementary to the DNA region, and happens through DNA polymerasis using the four deoxis nucleotids (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Together with them dideoxy nucleosides are introduced, so that once inserted into the DNA strand syntesis, are able to cause its stop. Inserting a low amount of these Dideoxy nucleoside, several strands with different lenghts will be obtained, related to the point in which the blocking agents have been merged. These ddNTPs are usually marked radioactively or flourescent-wise, in order to allow a subsequent visualization.
The fragments are then separeted accordingly to their length by the sequencer. Sequencing is characterized by five different phases:

• Amplification (PCR) and verification of amplified;
• Verification, purification and quantification or PCR products;
• Amplified sequencing;
• Sequences purifing;
• Sequencing products preparation: detailed electrophoresis and analisys of the obtained sequences, in according to the referring gene .

Nowadays direct sequencing is the gold standard for the first and second level test as well as for the confirmation of the mutation detected via screening test like HRMA.

CHIARA LUPO e IRENE BERTOLOTTI

DEFINIZIONE

Il deficit di G6PD, detto anche favismo, è la carenza congenita di un enzima normalmente presente negli eritrociti, la glucosio-6-fosfato-deidrogenasi, essenziale per la vitalità delle emazie ed in particolare per i processi ossidoriduttivi che in essi si svolgono. La carenza di questo enzima si traduce in una minore capacità delle emazie di resistere al danno ossidativo con conseguente accorciamento della vita media in circolo. Si verifica un'improvvisa distruzione dei globuli rossi (emolisi) e quindi la comparsa di anemia emolitica con ittero, quando il soggetto che ne è carente, ingerisce fave, piselli, varie droghe vegetali o alcuni farmaci che agiscono da "fattori scatenanti", inibendo cioè l'attività della glucosio-6-fosfato-deidrogenasi eritrocitaria, impoverendo ulteriormente i globuli rossi che sono già carenti dell'enzima.

EPIDEMIOLOGIA

È diffuso soprattutto in Africa (nei bantu raggiunge una frequenza del 20% circa) ma si riscontra spesso anche nelle popolazioni dell'Asia meridionale e del bacino mediterraneo, dove in alcune zone (Grecia, Sardegna) raggiunge una frequenza variabile dal 4 al 30%.
Si ritiene che questa vasta distribuzione possa essere in rapporto a un vantaggio selettivo legato alla presenza di emazie con carente espressione dell’enzima G-6-PD, che risulta inibente nei confronti della crescita di parassiti malarici. Al contrario la carenza dell’enzima G-6-PD ha un effetto positivo sullo sviluppo dell’ anemia falciforme (elevata incidenza di questa mutazione nei neri con malattia falcemica).

Il gene codificante la G6PD è situato sul cromosoma X: risultano quindi colpiti i maschi (omizigoti), che in genere ereditano il difetto dalla madre eterozigote (la condizione di omozigosi femminile è estremamente rara.).

GLUCOSIO-6-FOSTATO DEIDROGENASI

La proteina monometrica è costituita da 514 amminoacidi e ha un peso molecolare di 59 kD; per la formazione della forma attiva dell’enzima (dimero o tetrametro) è necessaria la presenza di NADP+, che viene legato in siti specifici presumibilmente localizzati all’interfaccia tra le due subunità di ciascun dimero.
In base alla mobilità elettroforetica si distinguono due tipi di enzima normale:
-il tipo A, più frequente nella popolazione africana, a rapida mobilità
-il tipo B,largamente diffuso in tutte le popolazioni, a lenta mobilità
Il deficit può essere definito come A+ o A-, B+ o B- a seconda del tipo di enzima, e se questo risulta essere presente in quantità normale o diminuita. La carenza enzimatica è espressa principalmente nelle cellule eritroidi e in grado minore nelle altre cellule ematiche: l’assenza di questa attività enzimatica estesa alle cellule di tutti i parenchimi sarebbe incompatibile con la vita.
In base alla severità del quadro emolitico associato, si riconoscono diverse classi di mutazione della G6PD:
mutazioni di classe I:
spiccata riduzione dell’attività enzimatica, in genere inferiore al 5%. E’ frequente nella razza caucasica e si associa a emolisi cronica esacerbata da esposizione ad agenti ossidanti;
mutazione di classe II:
rientrano in questo gruppo soggetti di varie razze con riduzione dell’attività enzimatica inferiore al 10%, con emolisi grave;
mutazione classe III:
comprende pazienti ematologicamente normali con deficit di attività moderato (attività residua 10-60%) ed emolisi autolimitantesi in seguito all’ esposizione a ossidanti.

LA VIA DEL PENTOSIO FOSFATO

Nei tessuti animali, la maggior parte del glucosio che viene consumato è catabolizzato attraverso la via glicolitica fino a piruvato; il piruvato a sua volta viene ossidato nel ciclo dell’acido citrico. La funzione principale del catabolismo del glucosio attraverso queste vie è la produzione di ATP. Vi sono però altre vie cataboliche che, partendo dal glucosio, portano alla formazione di prodotti specializzati necessari alla cellula. Di particolare importanza è la via dei pentosi fosfato.
La via del pentosio fosfato, chiamata anche via del fosfogluconato, produce NADPH e ribosio5-fosfato.
Una funzione della via del pentosio fosfato è quella di generare pentosi essenziali, in particolare D-ribosio, usati nella biosintesi degli acidi nucleici.
La glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) è l'enzima che catalizza la prima reazione della via dei pentoso fosfati, cioè la deidrogenazione del glucosio-6-fosfato a 6-fosfogluconolattone, utilizzando come cofattore una molecola di NADP+ (Nicotinammide Adenin Dinucleotide Fosfato) che preleva gli equivalenti riducenti dal carbonio 1 del glucosio-6-fosfato:

D-glucosio 6-fosfato + NADP+ ⇄ D-glucono-1,5-lattone 6-fosfato + NADPH + H+

Tale reazione è la prima della fase detta ossidativa, che ha lo scopo di trasformare uno zucchero aldoso a sei atomi di carbonio (con un gruppo fosfato al carbonio 6) in uno zucchero pentoso (con un fosfato al carbonio 5), il ribosio-5-fosfato, a partire dal quale viene sintetizzato il fosforibosilpirofosfato (PRPP), necessario per la biosintesi dei nucleotidi purinici e pirimidinici.

NADPH

Il nicotinamide adenin dinucleotide fosfato (NADP+) è composto da due nucleotidi uniti insieme mediante un legame fosfoanidridico tra i loro gruppi fosforici. Questo coenzima può subire una riduzione reversibile dell’anello nicodinamidico quando una molecola di substrato va incontro ad ossidazione (deidrogenzione), perdendo due atomi di idrogeno, la forma ossidata del coenzima accetta uno ione ioduro e si trasforma nella forma ridotta (NADPH). La riduzione di NADP+ converte l’anello benzenoico della nicotinamide (con una carica positiva sull’azoto dell’anello) nella forma chinonoide (priva di carica sull’azoto).
Il NADPH (ridotto) è generalmente presente nelle cellule in quantità maggiori rispetto alla sua forma ossidata, favorendo il trasferimento di ioduro dal NADPH, infatti il NADPH è di solito il cofattore delle riduzioni anaboliche.
Il NADPH è un trasportatore di energia chimica sotto forma di potere riducente , che rappresenta il riducente universale delle vie anaboliche. Questa funzione è particolarmente importante nei tessuti in cui sono attive le biosintesi degli acidi grassi e degli steroli da precursori semplici (esempio: ghiandola mammaria, corteccia surrenale, fegato, tessuto adiposo). Questi tessuti utilizzano il NADPH per ridurre i doppi legami e i gruppi carbonilici degli intermedi di questo processo. In altri tessuti, come il muscolo scheletrico, meno attivi nel sintetizzare acidi grassi questa via è praticamente assente.
La fase ossidativa della via dei pentoso fosfati è la maggior fonte di NADPH nelle cellule animali. Il NADPH provvede a fornire gli equivalenti riducenti per le reazioni biosintetiche e per le ossidoriduzioni coinvolte nella protezione dalla tossicità delle specie reattive dell’ossigeno (ROS).
Protegge infatti le cellule dai danni ossidativi causati dal perossido di idrogeno (H2O2) e dai radicali liberi superossidi, che sono sottoprodotti metabolici o che vengono generati da alcuni farmaci (come la primachina) e da prodotti naturali come la divicina, l’ingrediente tossico delle fave. Durante le reazioni di detossificazione, H2O2 viene di solito convertito in H2O dall’enzima glutatione perossidasi e dal glutatione nella sua forma ridotta; quest’ultimo così ossidato viene a sua volta ridotto di nuovo dall’enzima glutatione reduttasi e dal NADPH. H2O2 viene anche degradato ad H2O e O2 dall’enzima catalasi che richiede come cofattore il NADPH. Gli individui carenti di G6PD producono NADPH in quantità ridotte ed in questo modo vengono bloccate le reazioni di detossificazione di H2O2. Ne conseguono perossidazione lipidica con rottura della membrana degli eritrociti, e ossidazione proteica del DNA.

Il NADPH funge anche da fonte di equivalenti riducenti per le idrossilazioni dei composti aromatici (compresi gli idrocarburi policiclici cancerogeni), degli steroidi, dell'alcol e dei farmaci mediate dal sistema del citocromo p450.
Il NADPH è anche usato per i pathways anabolici, come la sintesi di lipidi, di colesterolo e per l'elongazione delle catene degli acidi grassi.

Infine, studi molto recenti hanno dimostrato che il NADP+ e' un regolatore diretto dell'espressione genica e della longevita'. Esistono oramai molte pubblicazioni che attribuiscono tale effetto a delle proteine NADP-dipendenti chiamate "sirtuine" (SIRTs). Tali proteine sono state inizialmente studiate nel lievito, ma la loro fisiologia e biochimica è comparabile a quella delle cellule animali. Tramite il NADP+, le sirtuine regolerebbero la funzione di un oncosoppressore (p53), coinvolto nei meccanismi di arresto cellulare, differenziamento, senescenza e morte cellulare.

SINTOMATOLOGIA

In caso di emolisi cronica: anemia moderata, subittero, reticolocitosi, modesta splenomegalia, calcolosi bilirubinica
In caso di emolisi acuta: brividi, febbre, cefalea, vomito, dolore addominale intenso, anemizzazione brusca, ittero emolitico, urobilinuria e possibile emoglobinuria

DIAGNOSI

- dosaggio, tramite misurazione spettrofotometrica della percentuale di riduzione di NADP+ a NADPH, dell’attività enzimatica G6PD;
- test di riduzione della metaemoglobina;
- test di stabilità del glutatione;
- test di formazione dei corpi di Heinz.

PATOGENESI

L’anomalia genetica è estremamente eterogenea: sono note sino ad oggi oltre 300 mutazioni della G-6-PD, che possono comportare una diminuita sintesi della proteina o, più frequentemente, la sintesi di una proteina con minore stabilità o minore affinità per il substrato.
La ridotta attività della G6PD comporta una diminuita produzione di NADPH, con conseguente riduzione della disponibilità di glutatione ridotto. Ciò comporta un’incapacità dell’eritrocita di mantenere ridotti i gruppi tiolici delle proteine di membrana, degli enzimi e soprattutto di opporsi all’ossidazione spontanea o indotta da agenti chimici dell’emoglobina.
L’emoglobina tende dunque a precipitare con formazione dei corpi di Heinz, (si pensa che il processo possa essere favorito dalla presenza di una certa quantità di metaemoglobina, che si forma in caso di emolisi).

Le emazie con corpi di Heinz superano con difficoltà il filtro splenico.
Vi sono numerose condizioni in cui pazienti con deficit della G-6-PD vanno incontro a episodi di emolisi massiva: farmaci ad azione ossidante (ASA, ac. Nalidixico,cloramfenicolo, doxorubicina ecc), ingestione di fave o piselli che contengono sostanze non note ad azione lesiva sulla stabilità eritrocitaria, la presenza di fatti infettivi, verosimilmente per la liberazione di perossido d’idrogeno da parte di leucociti in attività fagocitaria.
Esistono diverse forme cliniche:

Forma congenita precoce: quasi esclusivamente nei maschi, si manifesta talora già alla nascita con ittero neonatale grave che può portare al quadro di ittero nucleare e che simula la malattia emolitica del neonato da incompatibilità Rh. Questo quadro, superata la fase acuta, può andare incontro a remissione parziale.

Forma congenita giovanile: emolisi cronica parzialmente compensata che può andare incontro a crisi emolitiche in caso di assunzione di agenti ossidanti (farmaci, fave o piselli). Possibili crisi di deglobulizzazione su base iporigenerativa, secondaria a infezione virale o a deficit di folati.

Favismo: la crisi emolitica acuta, in seguito all’ingestione di fave, si manifesta nei casi conclamati con malessere generale, brividi, febbre, cefalea, vomito e ittero. Nei casi più gravi possono associarsi dolori addominali ed ematuria macroscopica per emogliobinuria massiva. L’emolisi in genere si autolimita, dal momento che le emazie più giovani hanno in genere un’attività enzimatica più elevata in grado di riparare il danno ossidativi.

TERAPIA

Prevenzione delle crisi emolitiche mediante l’astensione da farmaci ossidanti, fave e piselli. In caso di crisi emolitiche: promuovere abbondante diuresi e trasfusioni in caso di livelli di Hb pericolosi per la vita

Farmaci con rischio stabilito di causare emolisi nella maggior parte dei soggetti con deficit di G6PD
- dapsone ed altri sufoni (i dosaggi piu’ alti usati per la dermatite erpetiforme sono piu’ a rischio di causare disturbi);
- cloruro di metionina (blu di metilene);
- niridazolo;
- nitrofurantoina;
- pamachina;
- primachina;
- chinolonici (come ciprofloxacina, acido nalidixico, norfloxacina, ofloxacina);
- sulfonamidi (come cotrimossazolo).

Farmaci con rischio probabile di causare emolisi in alcuni dei soggetti con deficit di G6PD
- aspirina (accettabile con dosaggio di 1 mg al giorno nella magior parte dei soggetti);
- clorochina (accettabile nella crisi acuta di malaria);
- probenecid;
- chinidina (accettabile nella crisi acuta di malaria);
- chinina (accettabile nella crisi acuta di malaria);
- menadione, derivati idrosolubili.

DEFICIT G6PD e MALARIA

La distribuzione geografica di questa patologia ha una certa importanza. Si riscontra con una frequenza del 25% nelle zone malariche come l’Africa tropicale, parti del Medio Oriente e il Sud-Est asiatico. In aggiunta ad alcune evidenza epidemiologiche, studi in vitro hanno dimostrato che la crescita di un parassita della malaria, Plasmodiunm falciparum, viene bloccata negli eritrociti carenti di G6PD. Questo parassita infatti è molto sensibile ai danni ossidativi e viene ucciso ad un livello di stress ossidativi che è ancora del tutto tollerabile dall’ospite umano che ha il deficit di G6PD. Poiché il vantaggio di resistere alla malaria compensa lo svantaggio di essere meno resistenti ai danni ossidativi, in una popolazione soggetta alla malaria la selezione naturale privilegia il genotipo carente di G6PD.